LA RICERCA

La prima mutazione patogena del DNA mitocondriale umano è stata identificata nel 1988. Negli ultimi 30 anni, la ricerca sulle malattie mitocondriali ha avuto uno sviluppo molto rapido ed è in continua evoluzione. A tutt'oggi sono state descritte centinaia di mutazioni patogene del DNA mitocondriale.
Ci sono però numerose proteine, codificate da geni nucleari, che fanno parte o controllano la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e la corretta funzionalità mitocondriale, le cui mutazioni possono essere causa di malattia mitocondriale (vedi sezione “La classificazione delle malattie”). L'enorme eterogeneità clinica, biochimica e molecolare di queste patologie rende ogni proteina presente nei mitocondri (per un totale stimato di 1000-1500) candidata a causare fenotipi patologici.
Durante tutti questi anni, ricercatori "di base" e ricercatori "clinici" si sono uniti a formare una vera e propria "task-force" per identificare tutti i geni nucleari le cui mutazioni causano malattie mitocondriali, e per chiarire molti aspetti ancora oscuri della biologia e della patologia dei mitocondri. In Europa esiste una rete di collaborazioni tra più di 50 laboratori di ricerca, tra cui il nostro, specializzati in diverse discipline, per definire i meccanismi molecolari, cellulari e fisiopatologici delle malattie mitocondriali con lo scopo di identificare terapie efficaci.

I nostri programmi di ricerca principali sono:

Grazie a sforzi collaborativi nazionali ed europei, necessari per lo studio di patologie rare, il Centro Fondazione Mariani per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche ha identificato negli anni numerose nuove patologie mitocondriali causate da mutazioni in geni nucleari specifici.
A titolo esemplificativo riportiamo i principali: SURF1 (Tiranti et al. 1998); ETHE1 (Tiranti et al. 2004); MPV17 (Spinazzola et al. 2006); TUFM (Valente et al. 2007); SDHAF1 (Ghezzi et al. 2009); FASTKD2 (Ghezzi et al. 2010); TTC19 (Ghezzi et al. 2011). Questi studi sono stati svolti utilizzando approcci classici (analisi di linkage, mappaggio di omozigosità), che richiedono molto tempo per l’analisi e hanno maggior probabilità di successo se applicati a grandi famiglie, con più soggetti affetti.

Da qualche anno sono state sviluppate nuove tecnologie di sequenziamento (NGS) e strumenti informatici che offrono la possibilità di analizzare rapidamente e a basso costo le regioni codificanti del genoma umano, permettendo di sequenziare sia un gruppo selezionato di geni (pannelli genici) o la totalità di essi (esoma). Nel caso dei pannelli genici essi offrono un eccellente compromesso tra costi in termini economici e di tempo per analizzare un gruppo di geni noti per causare malattie mitocondriali (vedi sezione “La diagnostica"); l’esoma, invece, consente di estendere l’analisi a tutti i geni presenti nel DNA ma risulta più dispendioso in termini di tempo, costi e analisi bioinformatica dei dati prodotti. I pannelli attualmente in uso analizzano in una corsa singola 230 geni, il numero di geni inseriti viene continuamente aggiornato e incrementato in base alla costante revisione della letteratura. Al fine di sfruttare i vantaggi di entrambe le tecniche, nella nostra unità di Neurogenetica molecolare abbiamo sviluppato un approccio combinato a due fasi per analizzare grandi coorti di pazienti mitocondriali: esso si basa sull’utilizzo di un pannello genico mitocondriale in prima analisi, utilizzato anche a scopo diagnostico, seguito dal sequenziamento dell’esoma per i casi rimasti irrisolti e potenzialmente più informativi.
L’utilizzo di tecnologie NGS ha notevolmente incrementato la velocità di identificazione di nuovi geni malattia per tutte le patologie ereditarie. Un ulteriore vantaggio delle tecniche NGS è la possibilità di applicarle anche a casi singoli e sporadici. Il nostro gruppo ha sfruttato negli ultimi anni (e sfrutta tuttora) questi approcci, rivestendo un ruolo fondamentale nell’identificazione di molti geni malattia, anche grazie alla collaborazione con alcuni centri specializzati per l’analisi dell’esoma (Cambridge, Monaco)
Dalle analisi genetiche si giunge a identificare sia mutazioni già descritte in letteratura sia nuove varianti a carico del DNA che possono colpire geni già noti o nuovi geni candidati. Per questo tipo di varianti si rende necessaria una successiva fase di validazione funzionale, articolata in una serie di esperimenti finalizzati a dimostrare le conseguenze biologiche della mutazione e il suo ruolo diretto nel causare la malattia. A tale scopo saggi funzionali sono condotti in vitro sia su cellule del paziente (fibroblasti o cellule muscolari) che su cellule di controllo alla ricerca di alterazioni biochimiche, metaboliche o strutturali che possano dimostrare l’associazione tra genotipo mutato e fenotipo patologico. Questo è necessario per discriminare le mutazioni patogenetiche (responsabili della malattia) dalle varianti del DNA, dette polimorfismi, che sono responsabili della variabilità biologica presente tra gli individui ma non sono causative della malattia.

Per ottenere indicazioni sulla funzione fisiologica delle proteine oggetto di studio e sulle modificazioni dei meccanismi cellulari in caso di alterazioni della stessa sono creati e studiati modelli in vitro e in vivo; una miglior conoscenza delle basi biologiche delle patologie mitocondriali è il primo passo nella ricerca di nuove strategie terapeutiche.
Le cellule ottenute dai paziente (soprattutto fibroblasti o cellule muscolari; vedi sezione “La diagnostica) sono un ottimo modello “naturale” da utilizzare per studiare i meccanismi patogenetici alla base delle malattie.
Il gruppo della dott.ssa Tiranti ha accumulato negli ultimi anni esperienza nella creazione di un particolare tipo di modello cellulare, chiamato iPSc (inducible Pluripotent Stem cells), a partire da fibroblasti. Le cellule iPS sono molto versatili e possono essere “trasformate” in vitro in diversi tipi cellulari (es. neuroni, miociti, cardiomiociti…), che rappresentano un modello cellulare più fedele, rispetto ai fibroblasti, per patologie neurologiche e muscolari.
Infine i modelli animali di Mitocondriopatie, la cui caratterizzazione è svolta in collaborazione con l’Unità di Biologia Mitocondriale di Cambridge, rappresentano il sistema modello per la valutazione finale di possibili approcci terapeutici, sia basati su trattamenti farmacologici che su terapia genica.

Il processo di ricerca che va dalla scoperta del gene causativo, all’identificazione del meccanismo cellulare danneggiato, allo sviluppo di una terapia è molto lungo. Il caso di ETHE1 è emblematico. Nel 2004, il nostro centro ha identificato il gene ETHE1, quale responsabile di una grave malattia metabolica infantile, l'Encefalopatia Etilmalonica, che colpisce il cervello, il tratto gastrointestinale e i piccoli vasi sanguigni. Nel 2009 è stato chiarito il meccanismo patogenetico della malattia, che risiede in un difetto nel catabolismo dello zolfo inorganico a livello mitocondriale. Tale difetto determina un accumulo in vari tessuti di acido solfidrico (H2S), una sostanza gassosa in grado di inibire l'attività della COX e di altri enzimi del metabolismo energetico. Aver chiarito il meccanismo patogenetico della malattia ha permesso di testare negli animali interventi terapeutici (metronidazolo e N-acetilcisteina) mirati a ridurre la produzione o a tamponare l'accumulo di H2S; i dati positivi ottenuti nel modello animale hanno portato alla somministrazione di questi farmaci in alcuni pazienti, confermando gli effetti benefici (2010).
Ulteriori informazioni sui meccanismi patogenetici alla base della Encefalopatia Etilmalonica ottenute in vitro e in vivo, hanno portato a ipotizzare il trapianto di fegato come trattamento. Questo approccio è stato eseguito nel 2016 a Roma su una bambina con mutazioni ETHE1, con risultati molto incoraggianti.


Il Centro Fondazione Mariani per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche cerca quindi di rispondere a tutte le domande aperte in questo campo. Siamo impegnati a sviluppare test molecolari rapidi ed efficienti per implementare la diagnostica delle patologie di interesse, mediante l'uso di una serie di piattaforme di screening mutazionale ad alta efficienza. L'obiettivo, che fa parte di una collaborazione trans-nazionale con altri centri affini al nostro, è di ridurre sostanzialmente il gap diagnostico e offrire ai pazienti l'analisi esaustiva del proteoma mitocondriale. Analogamente, sul versante dell'analisi biochimica stiamo valutando sistemi su microscala che, ad es. su cellule in coltura, forniscano non solo il profilo biochimico della catena respiratoria, ma siano in grado di valutare le conseguenze metaboliche di eventuali deficit.
Sul versante delle terapie sperimentali stiamo orientando una parte rilevante della nostra attività verso la ricerca e la valutazione di approcci terapeutici efficaci nelle patologie della catena respiratoria. Questa iniziativa è ora possibile grazie allo sviluppo di numerosi modelli animali e cellulari ad hoc. Una serie di recenti osservazioni, in parte nostre, in parte effettuate in collaborazione con noi, o da gruppi di ricerca con cui siamo in contatto, ha aperto nuove possibilità terapeutiche per le malattie mitocondriali, sia sul versante farmacologico, che per quanto riguarda la terapia genica o cellulare e quella riabilitativa.


"Progetti di ricerca con la partecipazione di personale del Centro Fondazione Mariani per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche "

Allestimento banca di DNA.

Fibroblasti in coltura e modelli cellulari sperimentali.

Dosaggi biochimici degli enzimi mitocondriali su tessuti e cellule.

Sequenziamento di nuova generazione (NGS).