LA DIAGNOSTICA
La diagnosi di malattia mitocondriale si basa su un processo integrato e multidisciplinare, articolato in tappe successive.
Le informazioni ricavate dalla storia clinica del paziente e della famiglia, e dall'esame clinico vanno integrate con il risultato
delle indagini strumentali e di laboratorio. I neuropsichiatri infantili di riferimento (dott.ssa Isabella Moroni,
dott.ssa Anna Ardissone-U.O. Neuropsichiatria Infantile dell'Istituto Neurologico "C. Besta")
si occupano della valutazione clinica dei bambini con sospetta patologia mitocondriale mentre l 'ambulatorio dei pazienti adulti
è effettuato dalla dott.ssa Costanza Lamperti e collaboratori, della U.O. di Neurogenetica Molecolare (per approfondimenti
vd. "I nostri Servizi "). Queste malattie colpiscono prevalentemente il cervello e i muscoli;
quindi gli esami neuroradiologici, come la Risonanza Magnetica Nucleare, e neurofisiologici, come i Potenziali Evocati,
sono spesso indispensabili. Un esame fondamentale è, in molti casi, la biopsia muscolare, che si può esaminare al
microscopio ottico ed elettronico (studio morfologico), e fornisce il materiale biologico indispensabile per le indagini
biochimiche e per la ricerca delle mutazioni genetiche. Questo vale soprattutto nei casi pediatrici, in cui la sintomatologia
è spesso aspecifica e non è possibile stabilire con sicurezza la diagnosi sulla base del solo esame clinico.
Diagnostica di laboratorio
Per gli esami utili ad un primo screening è sufficiente un prelievo di sangue ed una raccolta delle urine delle 24 ore.
| Esame | Campione Biologico* | Commento |
| Glucosio | S | |
| Elettroliti | S | |
| Acido Lattico Acido Piruvico Alanina | S, L | Il prelievo di sangue deve essere effettuato senza laccio emostatico |
| Rapporto L/P | S | La valutazione del rapporto tra Lattato (L) e Piruvato (P) può essere molto utile nel determinare a quale livello della via metabolita è presente il difetto genetico |
| Ammonio | S | |
| Aminoacidi | S,U, L | La raccolta delle urine può essere fatta dopo un pasto o dopo un periodo di digiuno. Una "aciduria generalizzata" può indicare la presenza di una malattia mitocondriale |
| Acidi Organici |
U | La raccolta delle urine deve essere possibilmente delle 24 ore. Le urine, durante la raccolta, devono essere mantenute refrigerate in contenitore sterile e senza la presenza di conservanti. |
| Analisi delle Carnitine | S | Per una migliore interpretazione del dato, è meglio determinare le varie frazioni della carnitina: libera, esteri a corta e lunga catena, totale |
| Corpi chetonici | S,U | Da effettuare preferibilmente durante la crisi metabolica |
La valutazione dei risultati di questi esami da parte dello specialista può già orientare la diagnosi. Se però questi esami sono negativi,
questo non esclude completamente l'ipotesi di una malattia mitocondriale, ma sicuramente il sospetto diventa meno forte. In questo
caso può essere utile ripetere gli esami in particolari situazioni di stress energetico: durante una crisi metabolica spontanea
oppure eseguendo dei test metabolici (digiuno prolungato, carichi dietetici) da effettuarsi sotto stretta osservazione medica in regime di ricovero.
Tutti gli esami qui riportati, utili per il corretto inquadramento dei pazienti con malattie mitocondriali,
sono correntemente eseguiti presso il nostro Istituto
Biopsia muscolare
Attualmente viene eseguita mediante la tecnica "ad ago", che è molto meno invasiva rispetto alla tecnica "a cielo aperto"
che veniva utilizzata in passato. La biopsia ad ago viene effettuata in anestesia locale nei pazienti adulti e
in anestesia generale nei bambini. Non richiede punti di sutura, lascia una piccolissima cicatrice superficiale e
non interferisce in alcun modo con la funzione del muscolo biopsiato. E' importante che questo esame sia eseguito solamente
presso un centro altamente specializzato per garantire la correttezza tecnica del prelievo e l'idonea conservazione del materiale,
ma anche per assicurare l'esecuzione di tutte le indagini necessarie.
Sul tessuto muscolare biopsiato si possono eseguire le seguenti indagini:
In casi particolari, si possono effettuare anche indagini in microscopia elettronica,
utili per vedere la struttura dei mitocondri e valutare eventuali conformazioni anomale.
Biopsia cutanea
La biopsia cutanea e la successiva coltura di fibroblasti sono utili in molti casi:
Il nostro Centro possiede un patrimonio unico in Italia di più di 2000 linee di fibroblasti di pazienti con patologie metaboliche congenite. Queste linee cellulari, e >7000 campioni di DNA, sono presenti nella biobanca "Cell line and DNA Bank of Genetic Movement Disorders and Mitochondrial Disesases" facente parte del Network di Biobanche Genetiche di Telethon ed Eurobiobank.
Analisi genetiche
In seguito all'inquadramento clinico e all'indicazione degli esami strumentali e biochimici, il paziente giunge all'analisi genetica o del DNA. Le indagini biochimiche e le indagini molecolari sono solitamente effettuate in serie e quindi molto impegnative sia in termini di tempo che di costi. Spesso l'attesa per il paziente è anche di vari mesi e inoltre circa il 50% dei pazienti rimane senza diagnosi genetica di certezza in quanto, l'ancor insufficiente conoscenza dei meccanismi fisiopatologici alla base di queste patologie, rende ogni proteina della cellula ipoteticamente candidata a causare malattie. E' importante segnalare che, grazie alle moderne tecniche diagnostiche e all'incremento delle conoscenze, la percentuale di casi definiti dal punto di viste molecolare è in crescente aumento. L'identificazione della causa genetica è considerata, per le patologie ereditarie, come la più affidabile e definitiva classificazione della malattia (che pone fine alla cosiddetta "odissea diagnostica" dei pazienti con malattie rare).
L'offerta della diagnostica genetica della U.O. comprende indagini molecolari sia del DNA mitocondriale (mtDNA), compreso il sequenziamento completo e le analisi qualitative e quantitative, sia di geni nucleari associati a mitocondriopatia che vengono analizzati mediante sequenza diretta. La priorità dell'analisi viene discussa dai clinici referenti e dai genetisti della U.O. e decisa in base alla presenza di caratteristiche tipiche di sindromi mitocondriali note che vengono correlate al quadro neuroradiologico e al fenotipo biochimico (es. sindrome di Leigh, sindrome di Alpers, sindrome di Sengers, MNGIE, LBSL, LTBL). In presenza di queste sindromi è anche possibile l'accesso diretto alle indagini molecolari –senza dosaggi biochimici preliminari.
Da pochi anni, nuove tecnologie di sequenziamento (NGS) e strumenti informatici offrono la possibilità di analizzare rapidamente e a basso costo le regioni codificanti del genoma umano, permettendo di sequenziare sia un gruppo selezionato di geni (pannelli genici) o la totalità di essi (esoma).
Per razionalizzare le indagini molecolari, vista l'alta eterogeneità genetica delle malattie mitocondriali, nella nostra U.O. sono stati messi a punto pannelli di geni-malattia noti che analizzano in una singola corsa decine di geni mediante una piattaforma NGS. I pannelli a disposizione riguardano: Geni deficit Complesso I; Geni deficit Complesso II; Geni deficit Complesso III; Geni deficit Complesso IV; Geni deficit Complesso V; Geni deficit Coenzima Q; Geni deficit Complessi FeS; Geni deficit Complesso PDH; Geni Delezioni Multiple/Geni Deplezioni del mtDNA; Geni deficit Multiplo; Geni atrofie ottiche.
Oltre al sequenziamento di geni localizzati sul DNA nucleare, recentemente abbiamo esteso l'utilizzo delle tecniche NGS anche per l'analisi del mtDNA, tradizionalmente effettuata tramite sequenziamento diretto e Southern blot. I vantaggi di tale scelta si concretizzano sotto due aspetti principali: una maggiore sensibilità e accuratezza delle tecniche NGS a cui si aggiunge un risparmio sia in termini di costi che di tempo.
Fibre muscolari Rosse Stracciate (Ragged Red Fibers), tipiche di molte miopatie mitocondriali.
Doppia colorazione istochimica per la succinico deidrogenasi e COX: la fibra "ragged-blue" ha lo stesso significato delle fibre ragged-red: l'aumentata intensita' della reazione indica un'abnorme proliferazione mitocondriale.
Numerose fibre muscolari risultano negative (bianche) alla colorazione per la citocromo c ossidasi.
Modifiche ultrastrutturali: la microscopia elettronica mostra mitocondri anormali per forma e struttura.
Analisi del mtDNA mediante Southern blot: 1 e 7 wt; 2 e 3 delezioni multiple; 4 macrodelezione; 5 e 6 deplezione